Hücre kültürü
Glioblastoma hücre çizgisi GL261 ve serebral mikrovasküler hücre çizgisi bEnd.3, American Type Culture Collection’dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alınmıştır. GL261 ve bEnd.3 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin ve streptomisin içeren Dulbecco ile değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM) kültürlendi ve 37°C ve %5 CO2’de bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edildi.2.
SPIO-DOX kompleksinin (FeDOX) hazırlanması
SPIO nanopartikülleri (averaj çap, 50 nm; konsantrasyon, 2 mg/mL), Xi’an Delta Biological Technology Co., Ltd.’den satın alındı. Doksorubisin, MedChemExpress’ten (Monmouth Junction, NJ, ABD) satın alındı. SPIO çözeltisi, deiyonize damıtılmış su ile değiştirildi ve sonikasyon altında DOX çözeltisi ile karıştırıldı. SPIO parçacıkları ve DOX, naturel tepki yöntemiyle 37 °C’de bir banyoda 4 saat süresince inkübe edildi ve arkasından FeDOX kompleksini toplamak için fosfat tamponlu salin (PBS) ve manyetik çökeltme yavaş yavaş eklendi. İyi konjuge FeDOX kompleksi ve konjuge olmayan DOX moleküllerini ayırmak için toplanan FeDOX çözeltisi, 11.000 xg’de 3 dakika süresince santrifüjlendi ve arkasından PBS içinde tekrardan süspanse edildi.
Hücre zarı modifiye edilmiş mikrokabarcıkların (cellMB’ler) ve FeDOX@cellMB’lerin hazırlanması
MB’lerin lipid kabukları, 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC), 1,2-distearoil-snglisero-3-fosfo-rak-gliserol sodyum tuzu (DSPG) ve 1,2- kullanılarak sentezlendi. distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[methoxy(poly(ethyleneglycol))-2000] (DSPE-PEG2000) Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd’den 21:21:1 molar oranla satın alınmıştır; üç madde ışıktan korunarak kloroform ile çözüldü ve arkasından kloroform bir buharlaştırıcı (Yarong, Şangay, Çin) kullanılarak çıkarıldı. Oluşturulan kurutulmuş lipit film, gliserol PBS ile karıştırıldı ve sonrasında çözeltideki gaz boşaltıldı ve perfloropropan (C)3F8) eklendi. Son olarak MB’leri elde etmek için karışım bir karıştırıcı kullanılarak 60 saniye süresince çalkalandı.
CellMB’leri sentezlemek için kullanılan yöntem, ekstrakte edilen hücre zarının rotasyonel buharlaştırmadan sonrasında eklenmesi haricinde, MB’leri sentezlemek için kullanılan yönteme benzerdi. Özetlemek gerekirse, kafi hücre kültürlendi ve pankreatik enzimlerle sindirildikten sonrasında iki kez PBS ile yıkandı ve süpernatan, 1200 x g’de santrifüjleme yöntemiyle atıldı. Hücreler hipotonik tamponda tekrardan süspanse edildi ve bir proteaz inhibitörü eklendi. Hücre süspansiyonu buz üstünde 50 kez homojenleştirildikten sonrasında süpernatan, 4 ° C’de ve 3200 x g’de 5 dakika santrifüj edildikten sonrasında tutuldu. Bu adım iki kez tekrarlandı. Tüm süpernatanlar toplandı, 4°C’de 20.000 xg’de 20 dakika süresince santrifüj edildi ve çökelti atıldı. Süpernatan toplandı, 1 saat süresince 4°C’de 100.000 x g’de santrifüjlendi ve arkasından PBS ile topaklandı. Toplanan hücre zarları, çözünmüş lipit zarları içeren gliserol PBS’ye ilave edildi ve sonraki adımlar, MB’lerin sentezi için izlenenlerle aynıydı. FeDOX’a (4 mg) ek olarak FeDOX@cellMB’ler de aynı şekilde elde edildi. CellMB’lerin yapısı, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM, Leica, Almanya) kullanılarak gözlemlendi.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
Hazırlanan birkaç MB, karbon destek filmli çift taraflı bakır ağın üstüne damlatıldı ve naturel olarak kuruduktan sonrasında boyutları ve şekilleri TEM (H-600, Hitachi, Tokyo, Japonya) altında gözlemlendi ve fotoğrafları çekildi. FeDOX@cellMB’ler için FeDOX komplekslerinin yüklenmesi eş zamanlı olarak doğrulandı.
Nanopartikül seyretme analizi (NTA)
MB’lerin ve FeDOX@cellMB’lerin konsantrasyonu ve boyut dağılımı, Nanoparticle seyirci analizörü (Malvern, Malvern, UK) ve karşılık gelen ZetaView 8.05.14 yazılımı kullanılarak çözümleme edildi. Parçacık boyutunu ve konsantrasyonunu ölçmek amacıyla MB ve FeDOX@cellMB numunelerini seyreltmek için PBS kullanıldı. NTA ölçümleri kaydedildi ve çözümleme edildi. Isı ortalama 25°C’de ve PH 7,0’da tutuldu.
FeDOX kapsülleme verimliliğinin değerlendirilmesi
FeDOX@cellMB’ler PBS ile tekrardan süspanse edildi ve FeDOX@cellMB’leri yok etmek için 5 dakika süresince kendi geliştirdiğimiz yüksek yoğunluklu odaklanmış bir ultrason cihazıyla (1.1 MHz, 1 V, Biçim S1) işlendi. Özgür FeDOX içeren süpernatanlar santrifüjleme yöntemiyle toplandı. Çökelti toplandı ve FeDOX içeren MB’ler elde etmek için PBS içinde tekrardan süspanse edildi. Özgür FeDOX ve kapsüllenmiş FeDOX kompleksleri nitrifiye edildi ve indüktif olarak eşleşmiş plazma-atomik emisyon spektrometrisi (ICP-AES) tahmin edildi. Kapsülleme verimliliğini hesaplama formülü şöyledir:
Kapsülleme verimliliği (%) = (frac{Wencapsulated FeDOX}{Wecapsulated FeDOX+Wfree FeDOX})×100%
Kkapsüllenmiş FeDOX kapsüllenmiş FeDOX miktarı ve Wparasız FeDOX özgür FeDOX miktarıdır.
FeDOX@cellMB’lerin kontrastlı ultrasonografisi (CEUS)
Kontrastlı ultrasonografi (CEUS) için %2 (a/h) agaroz içeren bir kalıp hazırlandı ve numune kuyucukları olarak kalıpta 1,0 santimetre çapında üç ufak delik açıldı. CEUS, yüksek frekanslı doğrusal proba (frekans: 10 MHz) haiz bir klinik US görüntüleme sistemi (EPIQ7 US System, PHILIPS, Hollanda) kullanılarak gerçekleştirildi. 500 uL FeDOX@cellMB’lerden oluşan bir kısım, PBS ile 10 kez üç numune alma kuyucuğuna seyreltildi, prob konumu, üç numune alma kuyusunun aynı anda tamamen görüntülenebileceği şekilde ayarlandı ve her 10 dakikada bir ABD görüntüsü kaydedildi.
FeDOX@cellMB’lerin kararlılığı
Akustik stabiliteyi doğrulamak için yüksek frekanslı doğrusal proba (frekans: 10 MHz) haiz klinik ABD görüntüleme sistemi EPIQ7 ABD sistemi (PHILIPS, Hollanda) kullanıldı. FeDOX@cellMB’ler PBS ile 10 kez seyreltildi, agaroz kalıbına eklendi, devamlı araştırma için ultrasonik prob modelin üstüne yerleştirildi ve her 10 dakikada bir görüntüler alındı. İnceleme 1 saat sonrasında gerçekleştirildi ve FeDOX@cellMB’lerin kontrast artışı, kontrast-gürültü oranı (CNR) kullanılarak ölçüldü.
FeDOX@cellMB’lerin serum stabilitesini değerlendirme yöntemi şu şekildeydi: FeDOX@cellMB’ler %10 FBS ile 10 kez seyreltildi, 96 oyuklu plakaya eklendi ve %5 CO ile 37°C’de inkübe edildi2. FeDOX@cellMB’ler 0 dakika, 30 dakika, 1 saat, 2 saat, 6 saat, 12 ve 24 saatte mikrosantrifüj tüplerinde toplandı ve tortuyu süpernatandan ayırmak için santrifüjlendi. Son olarak, süre içinde FeDOX sızıntısını gözlemlemek için IVIS Lumina II in vivo optik görüntüleme (Caliper, ABD) kullanıldı.
FeDOX@cellMB’lerin GL261 hücreleri tarafınca hücresel alımı
BBB modelinin in vitro olarak başarıya ulaşmış bir halde oluşturulmasının arkasından, GL261 hücreleri, altta bir cam kapak bulunan reseptör odasına ekildi. 24 saatlik kültürlemenin arkasından, FeDOX@cellMB’leri içeren taze serumsuz ortam, hücre çanağının altında 0,48 T kalıcı mıknatıs (Chengdu Zhiyue Shuangchen Bioteknoloji Co., Ltd.) kullanılarak MT işlemiyle yada MT işlemi olmadan donör boşluğuna eklendi. Gruplara nazaran 5 dakika süresince FUS uygulaması olsun yada olmasın (1,1 MHz, 1 V) 10 dakika. 6 saatlik inkübasyonun arkasından alıcı boşluğu PBS ile iyice yıkandı. Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika süresince %4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitlendi. Çekirdekleri 15 dakika süresince lekelemek için 500 uL 500 nmol/L DAPI çözeltisinden oluşan bir kısım eklendi. Son olarak CLSM kullanılarak GL261 hücrelerinde DOX birikimi gözlemlendi.
Hücre sayma kiti-8 (CCK-8)
Hücre büyümesini değerlendirmek için bir CCK8 tahlili kullanıldı. GL261 hücreleri (4 × 103 hücre/kuyu) 96 kuyucuklu plakalara ekildi. PBS, DOX, FeDOX, cellMB’ler ve FeDOX@cellMB’ler, 10 dakika süresince hücre tabağının altında 0,48 T kalıcı mıknatıs kullanılarak ve FUS (1,1 MHz, 1 V) kullanılarak MT ile yada MT olmadan 2 saat süresince hücrelerle inkübe edildi. 5 dakika süresince 48 saat sonrasında her kuyucuğa 10 µl CCK8 solüsyonu kullanıldı, 1 saat inkübe edildi ve absorbans 450 nm’de ölçüldü.
Ortotopik GBM hayvan modeli
Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.’den satın alınan dişi C57BL/6 fareleri (6-8 haftalık) kullanılarak ortotopik bir GBM hayvan modeli oluşturuldu. Hazırlık ve dezenfeksiyonun arkasından, bregmayı açığa çıkarmak için kafa derisinde ortanca bir kesi yapılmış oldu. Sonrasında bregmanın 1,0 mm önünde ve sağ sagittal sütürün 2,0 mm haricinde bir delik (ortalama 1,0 mm çapında) açmak için ufak bir diş matkabı kullanıldı. Toplam 2 × 105/μL GL261 glioma hücreleri, 10 ul fosfat tamponlu salinde (PBS) tekrardan süspanse edildi ve bir mikroenjektörle yukarıdaki deliğe 3,0 mm derinlikte yavaşça enjekte edildi. Son olarak kesi tıbbi dikişlerle kapatıldı. Fareler tümör implantasyonundan 1 hafta sonrasında tedavi edildi.
Tüm hayvan deneylerinde, Sichuan Kanser Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Grant No. SCCHEC-04-2020-004) tarafınca gösterilen hayvan bakımı ve gözlem hayvanlarının kullanımına ilişkin yönergeler takip edildi.
In vivo manyetik ve FUS gözlem düzeneği
Tümör lokasyonuna transkranyal olarak FUS uygulandı (sinüs dalgası, PRF: 1100 kHz, akustik amplitüd: 1 V, sonikasyon süresi: 4 dakika). 0,48 T kalıcı mıknatıslı bir MT, tümör lokasyonuna 3 saat süresince sıkıca yerleştirildi.
Ortotopik GBM farelerinde FeDOX@cellMB’lerin biyolojik dağılımı
FeDOX@cellMB’ler (%0,9 düzgüsel salinle 10 kez seyreltilmiş 100 ul) ortotopik GBM farelerine kuyruk damarından enjekte edildi ve yüksek yoğunluklu FUS ile tedavi edildi. IVIS Lumina II in vivo optik görüntüleme (Caliper), farelerde 6 ve 12. saatlerde biyolojik dağılımı gözlemlemek için kullanıldı. Fare beyni ve floresans yoğunluğu yarı niceliksel olarak çözümleme edildi ve FeDOX@cellMB’lerin hedefleme verimliliği aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:
Hedef verimliliği = (Beyin floresans yoğunluğu/vücut floresans yoğunluğu) × %100.
Kuyruk damarına FeDOX@cellMB’lerin enjeksiyonu ve 2, 4, 6 ve 12 saat süresince yüksek yoğunluklu FUS ile tedaviden sonrasında fareler öldürüldü ve kalp, karaciğer, dalak, akciğer, böbrek ve beyin ayrıldı. FeDOX@cellMB’lerin beyin dokusunda ve öteki organlarda birikmesi, IVIS Lumina II in vivo optik görüntüleme (Caliper) kullanılarak gözlemlendi.
Son olarak dokular 24 saat süresince %4’lük paraformaldehit solüsyonunda bekletildi ve FeDOX@cellMB’lerin dağılımını gözlemlemek için parafin kesitleri hazırlandı.
FeDOX@cellMB’lerin in vivo anti ortotopik GBM aktivitesi
Kavitasyon tesirini tetiklemek, kan-beyin bariyerini (BBB) açmak ve aynı anda ilaçları salmak için kendi geliştirdiğimiz yüksek yoğunluklu bir FUS aletini kullandık. Anestezinin arkasından ortotopik GBM farelerinin başlarının üstündeki kürkleri tıraş edildi, yüzüstü pozisyona yerleştirildi ve ameliyat platformuna sabitlendi. Prob farelerin tümör bölgesine ayarlandı, karşılık gelen ilaçlar kuyruk damarından uygulandı ve FUS başlatıldı. MT operasyonu esnasında, farelerin kafa derisine 3 saat süresince sıkıca kalıcı bir mıknatıs yerleştirildi.
Ortotopik GBM fareleri rastgele üç gruba ayrıldı: 1) FeDOX@cellMB’lerin enjeksiyonunu takiben FUS sonikasyonu ve MT (FeDOX@cellMB’ler + FUS + MT grubu, n = 3); FeDOX kompleksi ve hücre MB’lerinin (FeDOX + hücre MB’leri + FUS + MT grubu, n = 3) enjeksiyonunu takiben FUS sonikasyonu ve MT; ve PBS enjeksiyonunun arkasından FUS sonikasyonu (PBS + FUS grubu, n = 3).
Fareler 14 gün süresince günaşırı tedavi edildi. Tedavi tesirini yansıtmak için IVIS Lumina II in vivo optik görüntüleme (Kaliper) kullanılarak tümör değişimleri gözlemlendi.
istatistiksel çözümleme
Tüm veriler averaj ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Kontrol grupları arasındaki farklar, iki kuyruklu eşleştirilmiş Talebe t testi, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Tukey’in post-hoc testi kullanılarak karşılaştırıldı. Tüm analizler SPSS yazılımı (IBM, Armonk, NY, ABD) ve GraphPad 6.0 kullanılarak yapılmış oldu. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlendi.
Source: jnanobiotechnology.biomedcentral.com