Malzemeler
MoS2 kristal Muke Nano Science and Technology Co., Ltd.’den (Nanjing, Çin) satın alındı. HS-PEG-NH2 (molekül ağırlığı (MW): 5000), Xi’an Ruixi biyolojik Co., Ltd. (Xi’an, Çin) tarafınca sağlanmıştır. 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT), Hoechst 33,258 ve Ham’s F12K ortamı Sigma-Aldrich’ten (St. Louis, ABD) elde edildi. Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve fetal sığır serumu (FBS), Gibco-BRL’den (Burlington, Kanada) satın alınmıştır. Annexin V-APC/7-AAD apoptoz tespit kiti Biolegend Company (San Diego, ABD) tarafınca sağlandı. Öteki tüm reaktifler J&K Scientific, Ltd.’den satın alındı ve daha çok saflaştırılmadan kullanıldı.
HS-PEG-Biyotin Sentezi
Biyotin (50 mg), EDC (17 mg) ve NHS (9 mg) ilavesinden ilkin dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözüldü. 2 saatlik reaksiyondan sonrasında aktifleştirilmiş biyotin, 40 mg/mL HS-PEG-NH’ye damla damla ilave edildi.2 sulu çözelti (5 mL) 5 dakika içinde karıştırıldı, arkasından 24 saat güçlü bir halde çalkalandı. Santrifüjlemenin arkasından elde edilmiş çözelti, iki gün süresince deiyonize suya karşı diyaliz edildi (3.5 kDa) ve liyofilizasyon yöntemiyle HS-PEG-Biyotin elde edildi.
MoS’nin hazırlanması2-PEG-Biyotin
Tek katmanlı MoS2 nanosheets daha ilkin bildirilen yönteme bakılırsa sentezlendi [25]. MoS’yi hazırlamak2-PEG-Biotin, SH-PEG-Biotin MoS2 yüzeyine aşılandı2 tiyollenmiş moleküllerin nano tabakaların kusur bölgelerine bağlanması yöntemiyle. Özetlemek gerekirse, MoS içeren 2 mL sulu çözeltiye 10 mg HS-PEG-Biotin eklendi.2 nano tabakalar (1 mg/mL). 10 dakika sonikasyon ve 24 saat karıştırıldıktan sonrasında, fazla HS-PEG-Biotin’i uzaklaştırmak için karışık çözelti yedi gün süresince deiyonize suya karşı diyaliz edildi (100 kDa) ve sonuçta ortaya çıkan MoS2-PEG-Biotin hemen sonra kullanılmak suretiyle 4 °C’de saklandı.
Karakterizasyon
Fourier dönüşümü kızılötesi (FT-IR) spektrumları, bir Tensor 27 FT-IR spektrometresi (Bruker) kullanılarak elde edilirken, UV-Vis-NIR absorpsiyon spektrumları, bir UV-2700 spektrofotometresi (Shimadzu) kullanılarak elde edildi. MoS’nin morfolojileri2 ve MoS2-PEG-Biotin nanotabakaları atomik kuvvet mikroskobu (AFM, Bruker) ile çözümleme edildi. Isı eğrileri kızılötesi termal kamera (220 s, Fotric AnalyzIR) kullanılarak elde edildi.
Hemoliz tahlili
MoS’nin hemolitik etkilerini belirlemek için2-PEG-Biotin, sıhhatli bir fareden alınan kırmızı kan hücreleri (0,8 mL), değişen MoS konsantrasyonları ile inkübe edildi2-PEG-Biyotin dispersiyonları (0,2 mL), santrifüj edilmeden ilkin 2 saat süresince yüksek hızda. Süpernatanın absorbansı, sırasıyla PBS ve deiyonize sudan oluşan negatif ve pozitif kontrollerle bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak ölçüldü. Hemoliz yüzdesi şu şekilde hesaplandı: hemoliz yüzdesi (%) = (A işlem görmüş-A negatif)/(A pozitif-A negatif) × %100, burada A absorbansı temsil eder.
MoS’nin sitotoksisitesi2-PEG-Biyotin
MoS’nin sitotoksisitesi2-PEG-Biotin, MTT tahlili kullanılarak değerlendirildi. A549 yada HELF hücreleri, 4 x 106 yoğunlukta 96 oyuklu plakalara ekildi3 ve 5 × 103 sırasıyla 24 saat süresince hücre/oyuk, arkasından MoS’nin gradyan konsantrasyonlarını içeren hücre ortamı ile inkübasyon2-PEG-Biotin 24, 48 ve 72 saat daha. Hemen sonra hücreler iki kez PBS ile yıkandı ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözümleme edilmeden ilkin 4 saat süresince MTT ajanı (100 μL) ile işlendi.
İlaç yükleme ve bırakma
Cur ve Er MoS’ye yüklendi2Cur’u (0,4 mg/mL) DMSO ve MoS içinde karışmasını sağlayarak -PEG-Biotin nano tabakaları2-PEG-Biotin sulu dispersiyonu (0,4 mg/mL), arkasından %70 DMSO’luk nihai konsantrasyona ulaşmak için Er çözeltisi (0,2 mg/mL) ilave edildi. Çözünmemiş ilaç katılarını uzaklaştırmak için santrifüjleme ve çözünmüş ilaçları uzaklaştırmak için ultrafiltrasyondan sonrasında, MoS2’ye yüklenen Cur ve Er miktarı2-PEG-Biotin-Cur/Er, MoS katkısının çıkarılmasından sonrasında 430 nm ve 335 nm’de emilim ölçülerek belirlendi.2-PEG-Biyotin sırasıyla.
Özgür bırakma davranışı MoS’nin içine daldırılarak değerlendirildi2-PEG-Biotin-Cur/Er nano tabakaları, ağırlıkça %0,5 tween-80 içeren PBS içindeki bir diyaliz torbasında ve bu tarz şeyleri 10 dakika süresince değişik yoğunluklarda 808 nm’lik bir lazere maruz bırakıyor. Diyaliz solüsyonu (1 mL) öncesinden belirlenen vakit noktalarında toplandı, UV spektrofotometri kullanılarak ölçüldü ve durağan(durgun) bir hacmi korumak için sisteme geri döküldü. Salınan Cur ve Er miktarı, sırasıyla 430 nm ve 335 nm’deki UV absorpsiyon zirveleri ile belirlendi.
Hücresel alım
MoS’nin floresan etiketlemesi2bazlı nano tabakalar, rodamin B’nin (RB) MoS2’ye fizyolojik adsorpsiyonu yöntemiyle elde edildi2-PEG-Biotin, RB sulu çözeltisini (1 mg/mL) MoS ile karışmasını sağlayarak2-PEG-Biyotin süspansiyonu (0,5 mg/mL), arkasından bağlanmamış RB’yi çıkarmak için ultrafiltrasyon yapılmış oldu. Etiketli MoS2-PEG-biotin-RB hemen sonra kullanılmak suretiyle 4 °C’de saklandı.
Biyotinle değiştirilmiş MoS’nin hücresel alımı2 nanosheets, A549 hücrelerinin (biyotin reseptörü pozitif) ve HELF hücrelerinin (biyotin reseptörü negatif) MoS’ye maruz bırakılmasıyla araştırıldı.2-PEG-RB yada MoS2-PEG-Biyotin-RB ([RB]= 20 μg/mL) 2 saat süresince PBS ile yıkama ve floresans yoğunluğunu konfokal mikroskopi ile çözümleme etme. Ek olarak hücrelerin floresans yoğunluğu, PBS ile üç yıkamadan, trypsin ile hasat edildikten ve PBS içinde tekrardan süspanse edildikten sonrasında bir akış sitometresi kullanılarak ölçüldü.
MoS’nin in vitro kombinasyon tedavisi2-PEG-Biotin-Cur/Er
MoS’nin in vitro sitotoksisitesi2-PEG-Biotin-Cur/Er, MTT tahlili kullanılarak A549 hücrelerinde değerlendirildi. Hücreler Cur, Er, Cur + Er ve MoS ile inkübe edildi2-PEG-Biotin-Cur/Er, 2 saat süresince çeşitli konsantrasyonlarda, PBS ile yıkandı ve taze ortamla 48 saatlik tedaviden sonrasında canlılık açısından değerlendirildi.
Kombinasyon tedavisi için A549 hücreleri altı gruba ayrıldı: denetim grubu, Cur, Er, Cur + Er, MoS2-PEG-Biyotin ve MoS2-PEG-Biyotin-Cur/Er ([MoS2-PEG-Biotin]= 100 μg/mL,[Cur]= 20 μg/mL ve[Er]= 10 μg/mL). 2 saatlik ilaca maruz kaldıktan sonrasında hücreler iki kez PBS ile yıkandı ve taze ortam sağlandı. NIR ışınlama grupları 808 nm lazere (1 W/cm2) maruz bırakıldı.2) 10 dakika süresince, ötekiler ise denetim olarak vazife yapmış oldu. Tedaviden sonrasında tüm hücreler, hücre canlılığını ölçmek için MTT tahlili yapılmadan ilkin 48 saat daha inkübe edildi.
Hücre apoptozu
İn vitro terapötik etkinliği daha çok değerlendirmek için hücre apoptozu, bir Annexin V-FITC/PI apoptoz tespit kiti ile akış sitometrisi kullanılarak çözümleme edildi. A549 hücreleri 6 oyuklu plakalara öncesinden ekildi ve sekiz gruba ayrıldı: (1) Denetim olarak hücre ortamı, (2) Cur, (3) Er, (4) Cur + Er, (5) MoS2-PEG-Biyotin, (6) MoS2-PEG-Biyotin + NIR, (7) MoS2-PEG-Biotin-Cur/Er ve (8) MoS2-PEG-Biotin-Cur/Er + NIR ([MoS2-PEG-Biotin]= 100 μg/mL,[Cur]= 20 μg/mL ve[Er]= 10 μg/mL). 2 saatlik ilaç tedavisinden sonrasında hücreler PBS ile yıkandı ve taze ortam verildi ve NIR ışınlama gruplarının kuyucukları 808 nm lazere (1 W/cm2) maruz bırakıldı.2) 10 dakika süresince. 48 saatlik bir inkübasyondan sonrasında hücre apoptozunu çözümleme etmek için Annexin V-FITC/PI boyaması yapılmış oldu.
Doku biyodağılımı
MoS2’nin doku biyodağılımı2-PEG-Biotin-Cur/Er, akciğer kanseri hücresi taşıyan çıplak farelerde araştırıldı. A549 hücreleri (5 × 1066 PBS (100 μL) içinde süspanse edilen hücreler) dişi BALB/C çıplak farelerin ön ayaklarına deri altından enjekte edildi. Averaj tümör hacmi ortalama 200 mm3’e ulaştığında3fareler rastgele iki gruba ayrıldı (grup başına n = 12) ve intravenöz olarak MoS uygulandı2-PEG-Cur/Er yada MoS2-PEG-Biyotin-Cur/Er ([MoS2-PEG-Biotin]= 8 mg/kilo,[Cur]= 1,6 mg/kilo ve[Er]= 0,8 mg/kilo). Evvelinde belirlenen vakit aralıklarında (2, 6, 12 ve 24 saat), rastgele üç fare öldürüldü ve doku örnekleri (kalp, karaciğer, dalak, akciğer, böbrek ve tümör) toplandı, tartıldı ve kral suyuyla sindirildi. Dokulardaki Mo miktarı hemen sonra indüktif olarak eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi (ICP-MS) kullanılarak belirlendi.
MoS’nin in vivo kombinasyon tedavisi2-PEG-Biotin-Cur/Er
MoS’nin in vivo kombinasyon tedavisi2-PEG-Biotin-Cur/Er, “Doku biyodağılımı” bölümünde açıklanmış olduğu benzer biçimde oluşturulan tümör modeli kullanılarak gerçekleştirildi. Averaj tümör hacmi ortalama 60 mm3’e ulaştığında3çıplak fareler rastgele sekiz gruba ayrıldı (n = 5 fare/grup) ve denetim olarak 200 μL (1) %0,5 DMSO (h/h) içeren PBS, (2) MoS enjekte edildi2-PEG-Biyotin, (3) Cur, (4) Er, (5) Cur + Er, (6) MoS2-PEG-Biyotin + NIR, (7) MoS2-PEG-Biotin-Cur/Er ve (8) MoS2-PEG-Biotin-Cur/Er + NIR ([MoS2-PEG-Biotin]= 8 mg/kilo,[Cur]= 1,6 mg/kilo ve[Er]= 0,8 mg/kilo). 12 saatlik intravenöz enjeksiyondan sonrasında, grup (1), (3), (4), (5), (6) ve (8)’deki çıplak fareler NIR ışınlaması (1 W/cm2) ile tedavi edildi.2) 10 dakika süresince tümörlerin gerçek zamanlı ısı değişimleri bir FLIR termal kamera kullanılarak seyredildi. Her farenin ağırlığı ve tümör boyutu her üç günde bir kaydedildi. Tümör hacmi şu formül kullanılarak hesaplandı: V (hacim, mm3) = uzunluk (mm) × genişlik2 (mm2)/2. Tedaviden 21 gün sonrasında tüm fareler öldürüldü ve hematoksilen-eozin (H&E) boyama için ana organlar toplandı.
istatistiksel çözümleme
Nicel veriler, minimum üç bağımsız deneyin averaj ± SD’si olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık, Öğrencinin TGraphPad Prism 5 yazılımıyla kontrol yada tek yönlü ANOVA. 0,05’ten minik bir p kıymeti istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Source: jnanobiotechnology.biomedcentral.com